DNA Squencing

1. Sejarah

DNA sequencing adalah pengurutan susunan nukleotida ke dalam kodon sepanjang peregangan DNA untuk ditranskripsikan1. Atau dapat diartikan sebagai metode untuk menentukan urutan-urutan basa nukleotida(A,C,G, dan T) dalam suatu gen dan asam nukleat2. Analisis sekuen menrupakan suatu teknik yang dianggap paling baik untuk melihat keanekaragaman hayati suatu kelompok organisme. Pada tahun 1975, penelitian mengenai pemetaan struktur gen dan kromosom berdasarkan pasangan basanya telah dimulai3. Dan pada akhir 1976, telah dipetakan 5386 nukleotida telah diurutkan. Pada tahun 2001, telah ditemukan sequence nukleotida dari 599 virus, 205 plasmid, 185 organel, 32 bakteri, jamur, 2 tumbuhan dan cacing. Dan berkembang terus hingga sekarang.

Keberhasilan tersebut didukung oleh 4 kemajuan utama dalam bidang biologi molekuler. Yang paling penting adalah dengan adanya penemuan enzim restriksi dan pengunaanya dalam membuat sampel homogen dari segmen tertentu dari kromosom. Di samping itu, penemuan terpenting juga adalah elektroforesis gel dan klon gen dalam jumlah yang banyak. Dan terakhir adalah teknik yang pertama kali dikembangkan oleh Sanger -yakni menggunakan dideoksinukleotida- dan Maxam-Gilbert -yakni perlakuan kimia.
2. Klasifikasi
a) Teknik kimia

Teknik yang pertama ini -ditemukan oleh Allan Maxem dan Walter Gilbert- menggunakan 4 reaksi kimia yang berbeda untuk memisahkan rantai DNA pada As,Gs,Cs, atau Cs + Ts. Metode ini memerlukan label radioaktif pada satu ujung dan pemurnian fragmen DNA yang akan disekuens. Sehingga sebuah seri dari fragmen yang dilabel dihasilkan dari ujung yang diradiolabel ke situs pemutusan pertama pada tiap molekul. Fragmen pada ke-empat reaksi diatur bersebelahan pada gel elektroforesis untuk pemisahan berdasarkan ukuran. Untuk memvisualisasi fragmen, gel diekspos kepada X-ray film untuk autoradiografi. Dan menghasilkan sebuah seri band yang gelap yang masing-masing mewakili fragmen DNA yang diradiolabel.
b) Teknik dideoksinukleotida3

- Teknik biasa
Teknik ini -ditemukan oleh Fred Sanger- menggunakan sintesis DNA secara in vitro dalam memisahkan nukleotida pada ujung fragment As,Gs,Cs,dan Ts.
Terminator yang sering digunakan adalah 2′,3′-Dideoksiribonukleosida trifosfat. Jika 2′,3′-Dideoksiribonukleotida ditambahkan pada ujung rantai, maka akan terjadi blok peregangan dari rantai karena ia tidak punya 3′-OH. Untuk 4 reaksi pemisahan yang berbeda, maka digunakan:
i. 2′,3′-Dideoksiribotimidin trifosfat(ddTTP)
ii. 2′,3′-Dideoksiribositidin trifosfat(ddCTP)
iii. 2′,3′-Dideoksiriboadenosin trifosfat(ddATP)
iv. 2′,3′-Dideoksiriboguanosin trifosfat(ddGTP)
sebagai terminator rantainya, dan populasi masing-masing akan terpisah pada basa yang sama(T,C,A, atau G).
Setelah fragmen DNA dipisah menjadi 4 reaksi paralel dan diperoleh rantai template dengan proses denaturasi, kemudian dipisah oleh elektroforesis gel poliakrilamid dan posisinya akan dideteksi oleh autoradiografi.
Fragmen terpendek akan pindah ke jarak terjauh dan mengarah ke anoda.

- Teknik otomatis
Hari ini, seluruh skala pada DNA sequencing dilakukan oleh mesin DNA sequencing yang menggunakan rantai dideoksi -terminator yang digunakan di atas- tetapi dengan sedikit modifikasi. Mesin yang berbeda menggunakan protokol yang berbeda. Adapun perbedaan utama dari teknik yang manual dengan yang otomatis adalah:
i. penggunaan pewarna fluoresen untuk mendeteksi DNA, pada teknik manual digunakan isotop radioaktif.
ii. Pemisahan produk -dari reaksi yang 4 tadi- menggunakan gel tunggal atau tabung kapiler.
iii. Menggunakan fotosel untuk mendeteksi pewarna fluoresen tadi.
iv. Transfer langsung dari fotosel ke komputer, sehingga dapat dilakukan analisis, rekaman, dan presentasi hasil secara otomatis.
Pada teknik otomatis, digunakan pewarna fluoresen yang berbeda untuk masing-masing reaksi, sehingga dapat ditampilkan template secara sekaligus dan menggambarkan urutan pasangan basanya langsung. Mesin otomatis ini jika digunakan terus-menerus, dapat memisahkan lebih dari 100000 pasang basa per hari.3